Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


También podrás encontrar diversas páginas y blogs relacionados con el mundo de la Microbiología. El material que se presenta en ellos puede ser utilizado en clase.


jueves, 14 de junio de 2012

Diversidad genética, dinámica, y actividad de la comunidad de Lactobacillus relacionada con la producción artesanal del queso manchego.


Genetic diversity, dynamics, and activity of Lactobacillus community
involved in traditional processing of artisanal Manchego cheese

Isabel Sánchez, Susana Seseña, Justa M. Poveda, Lourdes Cabezas, Llanos Palop 


Trabajo realizado por: Carlos Menor Ferrándiz, Mateo Leal Ferrández, Adrián García Sirera, Germán Antón Ruiz y Antonio Joaquín Lozano


INTRODUCCIÓN

El queso manchego es un queso español elaborado con leche de oveja de raza manchega, que está adaptada a la explotación del pastoreo en zonas áridas y protegido por una denominación de origen en La Mancha. La leche para elaborarlo puede ser cruda o pasteurizada. El  queso puede ser de dos tipos: prensado y duro (en función de su forma de preparación)
También puede clasificarse en tres tipos atendiendo a su grado de maduración: fresco, semicurado y curado.

El proceso de elaboración del queso manchego sigue las siguientes etapas: 
  • Ordeño y refrigeración de la leche
  • Coagulación y corte de la cuajada
  • Desuerado
  • Moldeado
  • Identificación 
  • Prensado
  • Volteado
  • Salado
  • Secado y maduración
La pasteurización previa de la leche será obligatoria para aquellos quesos de tipo frescos y los que se consuman antes de los dos meses tras su elaboración. 

Es básico para elaborar un queso realizar la cuajada. Es el único proceso necesario y consiste en separar los componentes de la leche, por acción de la temperatura o bacterias. 

La separación se logra desestabilizando la proteína de la leche (caseína). Este desequilibrio hace que las proteínas se aglutinen en una masa blanca, separándose del líquido (suero lácteo). 

Las bacterias utilizadas (Lactococcus sp, Lactobacillus sp, etc.) junto con las enzimas que producen y la leche de orígen, serán determinantes en el sabor del queso tras su añejamiento. Para elaborar quesos duros, se somete a la cuajada a temperaturas entre 33ºC y 55ºC, para que se deshidraten más rápido.ç


Como curiosidad, cabe destacar que las exportaciones de queso manchego certificado por la Denominación de Origen Queso Manchego ascendió durante 2011 a cerca de 10,4 millones de kilos frente a los 9,7 certificados en 2010, lo que supone un aumento de más del siente por ciento. El total de queso manchego exportado aumentó un 16,6 por ciento respecto a 2010, pasando de cuatro millones de kilos a 4,7.
La exportación a países de la Unión Europea creció el 13,7%, y un 18,9% a países comunitarios, ha informado la Denominación en nota de prensa. De nuevo Estados Unidos se constituyó en el primer destino exterior, con un total de 2,1 millones de kilos. También ha experimentado un notable avance la exportación a países de la UE.

OBJETIVO E HIPÓTESIS DEL TRABAJO


El siguiente artículo trata de intentar estudiar la composición de las NSLAB en los quesos manchegos. Para ellos se propuso caracterizar la comunidad natural de cepas de bacterias del ácido láctico presentes en las distintas etapas de la elaboración de estos quesos.

En la producción del queso, distinguimos dos variedades de bacterias: aquellas que se introducen al principio del proceso (iniciadoras o "starter"), y las NSLAB o bacterias del ácido láctico no iniciadoras. La presencia de las NSLAB se encuentra más allá del control del fabricante, e introduce una variabilidad en el proceso que induce sobre todo diferencias en sabor y la calidad entre distintos quesos de la misma variedad. Su origen puede variar, entrando en el proceso con la leche, con los ingredientes utilizados en la fabricación de queso, desde los alrededores...

MÉTODOS Y MATERIALES 

1      Muestreo de queso:

     Dos queserías de Castillas la Mancha (una de ellos con el premio “Gran selección”) a las que denominamos C y N. En cada quesería, se produjeron dos lotes de quesos (CA, CB, NA y NB) a partir de la misma leche cruda.

Para la producción de queso se añadió a la leche un iniciador comercial liofilizado de baja concentración (1% m/v) que contiene: Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp cremoris y Streptococcus thermophilus.

El queso fue madurado en las queserías bajo las condiciones tradicionales y transportado al laboratorio.

Por cada lote, se analizaron: la leche utilizada, la cuajada (cogida inmediatamente después del moldeado (día 0)), y quesos madurados durante 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32 y 48 semanas. La quesería N paró la maduración antes de las 48 semanas, por lo que no hay datos sobre esa muestra.

2    Aislamiento y agrupación de las bacterias del ácido láctico:


     Para la enumeración de los grupos microbianos, se utilizaron 4 medios de cultivo diferentes con sus condiciones de incubación, y cada análisis fue realizado por duplicado.


        5 colonias fueron tomadas al azar de cada placa, por cada medio y por cada muestra de cada lote. Estas colonias fueron consideradas como representantes de las cepas numéricamente dominantes presentes en el queso en cada etapa de la maduración. Estas cepas fueron subcultivadas.


      Se utilizó para este experimento una selección de cepas de L. plantarum, L. paracasei subsp. paracasei, L curvatus y L. pentosus, identificadas y genotipadas previamente utilizando la técnica RAPD. 


      Identificación de las cepas de Lactobacillus sp: 


      Para identificar estas cepas se realizaron: tinción de Gram, la prueba de la catalasa, morfología celular, producción de amoniaco a partir de arginina, y producción de dióxido de carbono a partir de glucosa. De 628 cepas aisladas, solamente el 33,5% fueron identificadas como Lactobacillus sp. 


     Amplificación por PCR:

Se extrajo ADN de cada cepa. Se utilizaron dos cebadores de secuencia arbitraria, realizando las amplificaciones por separado para cada cebador. 
·      
La técnica RAPD-PCR fue realizada utilizando extracto de DNA, cebador, dNTP, tampón Taq Mg, KCl, ((NH4)2SO4), Taq polimerasa y agua. Las PCR se llevaron a cabo en un PTC-100 Thermal Cycler.

Los productos de la PCR fueron analizados mediante electroforesis, utilizando como marcador de peso molecular Lambda DNA cortado con PstI.

Las fotografías que fueron tomadas del gel fueron digitalizadas para el análisis. Se utilizo el programa GelCompar 4.0 para comparar los diferentes geles.

La similitud de los resultados fue expresada por el coeficiente de correlación de Pearson (r), y fueron agrupadas por el método UPGMA (unweighted pair group method with arithmetical average).

Los trazos densitométricos obtenidos usando los dos cebadores fueron ensamblados para producir un único trazo densitométrico combinado para cada cepa y entonces es analizado como un patrón acumulativo de ADN,  dando un único dendograma de similitud.

La calidad del análisis de grupos fue verificando calculando el valor de correlación confenética.
Para el nivel de semejanza (r) se estableció un umbral de discriminación debajo de el cual los patrones son considerados diferentes.

Caracterización fisiológica: 

Se realizaron pruebas de acidificación y actividad enzimática, incubando cepas en leche y midiendo los resultados mediante un espectofotómetro. 

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 


 En esta gráfica visualizamos los resultados de la RAPD-PCR. Podemos observar los dos geles obtenidos por cada cebador y por cada cepa. El programa los agrupa según su similitud entre ellos y con las cepas modelo que se han comentado antes. Una similitud de un 90% indica que pertenecen a la misma cepa, y una similitud de un 54% indica que todas esas cepas pertenecen a la misma especie.



Estos dos gráficos representan la distribución de las especies identificas previamente en las distintas muestras tomadas en diferentes etapas de la producción de queso. 

La evolución es muy similar en ambas: 

- Observamos L. acidophilus en la leche o en el cuajo inicial en ambos quesos. 

- L. plantarum predomina durante la maduración del queso de manera similar en ambas queserías. 

- L. brevis y L. paracasei subsp. paracasei también siguen una dinámica parecida. 

Pero también observamos algunas diferencias como por ejemplo en la leche utilizada, en la que la quesería N la leche solo contiene L. paracasei subsp. paracasei, mientras que la leche utilizada en C contiene mas especies. 


En esta imagen prácticamente se puede corroborar lo que hemos interpretado las gráficas referentes a la dinámica de la población. 
                                                                            
Con respecto a los resultado que se obtuvieron en las pruebas de acidificación y actividad enzimática, cabe destacar que:

- L paracasei subsp. paracasei es la más acidificante y L. pentosus la menos acidificante.

- L. brevis es la que más actividad proteolítica mostró y L. plantarum y L.fermentum las que menos.

- L. curvatus mostró una actividad peptidasa muy débil, y la mayoría no mostró actividad.

- Las cepas mostraron mayor actividad en ácidos grasos cortos que en ácidos grasos largos. L. fermentum presentó la mayor actividad esterasa y L. plantarum la menor.


4 Conclusiones
De los resultados obtenidos se puede concluir que, a pesar de las diferencias entre las muestras de las dos industrias lácticas en cuanto a la composición de la comunidad natural de los Lactobacillus implicadas en la maduración del queso manchego.


3 especies: L. plantarum, L. paracasei subsp. paracasei y L.brevis predominaron sobre la microflora de Lactobacillus, con una sucesión idéntica durante la maduración. Eso sugiere que están bien adaptados al entorno del queso Manchego y las restricciones del queso curado.

Estas pequeñas diferencias en la población de Lactobacillus no son esenciales para la producción de queso manchego, aunque sí que pueden causar variaciones en el sabor y en el aroma entre los quesos de las diferentes industrias.

Los datos de la genotipación mostraros que la maduración fue dominada por un numero limitado de genotipos, a pesar de la detección  de una diversidad de genotipos en alguna de las etapas.
A pesar de todos los aislamientos realizados durante la producción de productos lácticos, se encontraron diferencias en la caracterización fisiológica.

A vista de los resultados obtenidos en el experimento, los genotipos Q14C, Q42C y Q35N de L. paracasei subsp. paracasei, L. brevis y L. fermentum respectivamente, fueron elegidas como cultivos relacionados con la obtención de la Denominacion de Origen Manchego. Estas cepas fueron obtenidas en quesos provenientes de la industria C, quesos con excelentes características sensoriales.


Enlaces de interés


Presentación seguida durante la exposición:


https://dl.dropbox.com/u/83970128/PPT%20final%20%28definitivo%29.pptx


Artículo a partir del cual se ha realizado el trabajo:


Enlace al artículo






martes, 12 de junio de 2012

LOS ANTIBIÓTICOS EN EL MICROBIOMA


Actualmente algunos ganaderos  administran en la dieta de algunos animales diversos tipos de antibióticos ya que obtienen beneficios al prevenir enfermedades y aumentan el peso del animal. En este estudio cuyo nombre original es “In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome” se tratan, mediante diversos métodos y estudios, los efectos colaterales de administrar estos fármacos en el microbioma intestinal porcino, como el incremento de lo genes de resistencia.  El enlace al artículo original es el siguiente: www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1120238109

Para confirmar la hipótesis se aislaron 12 cerdos divididos en dos grupos con distinta alimentación, a un grupo se le suministrara una dieta rica en antibióticos (ASP250) y al otro, se le dará la misma dieta, pero sin esos antibióticos. Se alojaran en un entorno altamente controlado. El tratamiento duró 3 semanas y se recogieron 12 muestras fecales (correspondientes  a cada cerdo) antes del tratamiento (día 0) y después del tratamiento (días 3, 14 y 21).
Se observaron a lo largo del tratamiento diversos  cambios:
Los filotipos bacterianos cambiaron después de 14 días de tratamiento con antibiótico, los cambios más importantes que se produjeron son el aumento de Proteobacteria, principalmente de E. coli ya que aumentó un 62% en animales medicados, y  la disminución de Bacteriodetes  que está relacionado con el aumento de Firmicutes, razón por la cual  puede deberse la promocion del crecimiento de los cerdos.

Las siguientes gráficas reflejan los resultados expuestos: en la primera se observa los filotipos bacterianos y los cambios que se producen en el día 14 debido a la ingesta de antibiótico, y en la segunda gráfica expone principalmente el gran aumento de E.coli en animales medicados:





Mediante el análisis de metagenomas se observaron otros cambios relacionados con genes funcionales:
Por una parte los relacionados con la producción y conversión de la energía, que se incrementaron  en cerdos con dieta rica en antibióticos, cuyos efectos se relacionaron con el aumento de peso del animal.
Y por otra parte, los genes de resistencia a antibióticos, ya que se observa un aumento en la diversidad de genes de resistencia en cada muestra  y la homogenización de estos en las muestras de los cerdos medicados, proporcionando al microbioma resistencia a los antibióticos que consumieron en la dieta.
Finalmente, se descubre que los cerdos presentan también resistencia a antibióticos no administrados en la dieta como por ejemplo en genes como Aminoglicosido O-fosfotransferasa que confiere resistencia a estreptomicina, lo que demuestra el potencial de selección indirecta a antibióticos no administrados.
En esta gráfica se puede observar el incremento de alguno de los genes mencionados:




Con los resultados obtenidos tras el estudio se confirma la hipótesis inicial: aunque los antibióticos tratan y previenen enfermedades producen efectos colaterales en los animales principalmente al modificar la microbiota intestinal del animal y la adquisición resistencias a antibióticos por esta microbiota.
En el siguiente enlace hay información adicional sobre el artículo:




ANTIBIOTIC MICROBIOMA

Nowadays, some farmers managed in the diets of some animals add various types of antibiotics that profit to prevent disease and increase the weight of the animal. In this study which its original name is "in-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome" are treated by different methods and studies, side effects of administering these drugs in the porcine intestinal microbiome, as the increase of the resistance genes. The link to the original text is:  www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1120238109
In order to confirm the hypothesis were isolated from 12 pigs divided into two groups with different food, a group provide him with a diet rich in antibiotics (ASP250) and the other will be given the same diet, but without these antibiotics. They will stay in a highly controlled environment. The treatment lasted 3 weeks and 12 fecal samples were collected (for each pig) before treatment (day 0) and after treatment (days 3, 14 and 21).
Were observed during the treatment several changes: The bacterial phylotypes changed after 14 days of antibiotic treatment, the most important changes that occurred Proteobacteria are increased, and mainly E. coli since increased by 62% in animals medicated, and decreased Bacteriodetes which is related to the increase in Firmicutes, reason may be the promotion of growth in pigs.

The following graphs reflect the results presented: the first shows the bacterial phylotypes and changes that occur on day 14 due to the intake of antibiotics, and in the second graph shows mainly the large increase of E. coli in animals medicated:




Metagenomes by analyzing other related changes were observed with functional genes:  On the one hand those related to production and energy conversion, which increased in pigs with antibiotics diet, the effects were associated with increased body weight. And moreover, the resistance genes to antibiotics, which are an increase in the diversity of resistance genes in each sample and the homogenization of these samples in medicated pigs, providing resistance to antibiotics microbiome consuming in the diet.
Finally, it is discovered that pigs also have resistance to antibiotics not administered in the diet such as in genes such as aminoglycoside O-phosphotransferase which confers resistance to streptomycin, demonstrating the potential for indirect selection of antibiotic unmanaged. This graph shows the increase in any of the genes mentioned:

The results obtained after study confirms the initial hypothesis: Although antibiotics treat and prevent diseases they also cause side effects in animals mainly by modifying the intestinal microbiota of the animal and the acquisition of antibiotic resistance by the microbiota.
The following link is additional information to the article:
http://www.pnas.org/content/suppl/2012/01/12/1120238109.DCSupplemental



Irene Varón Sánchez, Helena Ruiz Cano, , Emma Roig Molina, Mª Isabel Gómez Schiavon, Aida Escolano Vives.