Nuevo método para la producción a gran escala de PG-CNP37, un análogo de péptido natriurético del tipo C

(A novel method for the large-scale production of PG-CNP37, a C-type natriuretic peptide analogue)

Autores: Shinong Long∗, Daniel J. Wendt, Sean M. Bell, Timothy W. Taylor, Jean-Yves Dewavrin, Michel C. Vellard

Etiquetas:

CNP

Cuerpos de inclusión

CNP22

PG-CNP37

Ácido fórmico

TAFm

Introducción y contextualización

La acondroplasia (conocida coloquialmente como enanismo) es una enfermedad del grupo de trastornos que se denominan condrodistrofias u osteocondrodisplasias, que afectan a 1 de cada 2500 niños nacidos. Se trata de una de las causas más frecuentes en el acortamiento de huesos largos, manteniéndose constante la longitud de la columna vertebral, lo que proporciona esa característica morfológica al individuo afectado. Las causas se deben a mutaciones genéticas al azar en el 75% de los casos y el 25% restantes a desórdenes autosómicos dominantes (localizados en el receptor 3 del factor de crecimiento del fribroblasto, FGFR3), que generan anormalidades en la formación del cartílago.

Esta enfermedad no solo puede causar rechazo social, sino también desemboca en posibles complicaciones en la salud de la persona afectada, como hidrocefalia o pies zambos. Además, se ha demostrado que si ambos padres son acondroplásicos y tienen un hijo homocigoto para el gen mutante, su esperanza de vida apenas es de unas pocas semanas.

El estudio realizado por Shinong Long entre otros investigadores, en el artículo “A novel method for the large-scale production of PG-CNP37, a C-type natriuretic peptide analogue”, se basa en la síntesis económica a gran escala de un análogo de CNP (C-type natriuretic peptide), debido a la difícil y costosa producción de este. Tanto esta proteína como su análogo, el PG-CNP37, son un potente estimulador del crecimiento del hueso endocondral que produce mejoras en la actividad del FGFR3 (cuya mutación causa el desorden autosómico dominante ya descrito).

Para ello se emplean recombinantes de Escherichia coli, en los que el problema de degradación por las diversas proteasas se resuelve gracias al embalaje de la proteína recombinante expresada en cuerpos de inclusión. Todo ello ha supuesto un método de producción de alto rendimiento sencillo, donde se obtienen 0,5 g al 95 % de pureza de PG-CNP37 por litro de cultivo del reactor estándar.

Procedimiento y resultados

Para llevar a cabo el experimento se siguieron los siguientes pasos:

1.      Clonación de las proteínas de fusión TAFm-PG-CNP37 y expresión en E coli.

El gen de la proteína PG-CNP37 y el del dominio mutado de histona del factor de transcripción humano TAF12 (TAFm), se fusionaron para expresarlos como cuerpos de inclusión. Para ello, los residuos de ácido aspártico en TAF12 se cambiaron por ácido glutámico, evitando la ruptura con el ácido fórmico y una cisteína por alanina para evitar la formación no específica de enlaces disulfuro. Esta proteína de fusión se clonó en un vector de expresión transformado en E. coli BL21. A continuación se sembró en placas de agar LB con kanamicina (antibiótico utilizado para seleccionar las bacterias que han incorporado el vector de las que no), y cuando se alcanzó una absorbancia a 600 nm de 0,6, se añadió al medio celular IPTG (un inductor de la traducción de las proteínas recombinantes). Por último, mediante centrifugación se recolectaron los sedimentos celulares, que posteriormente fueron lisados.

2.      SDS-PAGE y método Western para la detección de la expresión de TAFm-PG-CNP37

El lisado total celular (sobrenadante y sedimentos) se separó por SDS-PAGE y analizó  mediante el método Western blot: la proteína fue transferida a una membrana de nitrocelulosa en I-Blot (Invitrogen), previamente bloqueada con leche desnatada al 5% en tampón TBS-T Para la inmovilización de la proteína buscada se emplearon anticuerpos policlonales, anti-CNP22 de  conejo. Por último, se visualizaron con 10 mL de Blue Western Stabilized Substrate. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:

Como se observa en la imagen, la gran mayoría de las proteínas fusionadas se encuentran en el lisado celular inducido con IPTG y en el Pellet (sedimento). El tamaño de la banda correspondiente a TAFm-PG-CNP37 es de 16 kDa: esto indica que se ha expresado como cuerpos de inclusión.

3.              Purificación de los cuerpos TAFm-PG-CNP37 y escisión con ácido fórmico.

El precipitado celular se resuspendió en tampón, se sonicó en hielo y se centrifugó a 2000 rpm durante 20 min a 4ºC. A continuación se resuspendió en tampón diluido y se repitió el proceso unas 3-5 veces hasta que el sobrenadante se volvió nítido. Se transfirió 1 mL de sobrenadante a tubos de 1,5 mL y se centrifugó a 14000 rpm durante 15 min. Se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se disolvieron en 500 µL de ácido fórmico a distintas concentraciones (50%, 10% o 2%) y temperaturas (25-70 C).

Analizando los resultados obtenidos, se observa que el mayor rendimiento era a 70 C durante 24 h, pero se obtenían productos no específicos, que hacían difícil la purificación mediante técnicas estándar de cromatografía. Por tanto, las condiciones seleccionadas para la escisión de los cuerpos se daban con una concentración al 2 % de ácido fórmico, a 55ᵒC y durante 24 h. En esas condiciones, la mayoría de las PG-CNP37 fueron separadas de las TAFm, obteniendo una banda del tamaño esperado.

 Por último, se neutralizaron los productos del corte con NaOH hasta alcanzar un pH 7 y se realizó el ensayo PAGE-SDS y LC/MS.

4.      Ensayo LC/MS

La elución de los péptidos se consiguió mediante un gradiente creciente de acetonitrilo, en presencia de agua y ácido trifluoroacético (0,05%). Los resultados del ensayo LC/MS confirmaron que la fracción soluble era principalmente PG-CNP37, mientras que la fracción insoluble estaba compuesta por TAFm y TAFm-PG-CNP37 no hidrolizado.

5.      Producción y purificación de PG-CNP37

Las células BL21 transformadas con el plásmido se cultivaron en un fermentador, obteniendo 8-10g/L de TAFm-PG-CNP37. El precipitado celular se resuspendió en un tampón salino de fosfato y se procedió a lisar el precipitado con un homogenizador de alta presión. El lisado resultante se llevó a centrífuga a 6500g durante 10 minutos y se le añadió ácido fórmico al 2% (para llevar a cabo la reacción de corte) al precipitado que contenía los cuerpos de inclusión insolubles. Tras otra centrífuga a 6500g durante 15 minutos, se obtuvo el producto de corte, PG-CNP37, en un 80 % de pureza, con una pérdida mínima por desnaturalización (fracción soluble). Mediante cromatografía de intercambio aniónico a un pH 7-7,2 (pI=10), se filtró el sobrenadante. Por último, se purificó el análogo mediante cromatografía de intercambio catiónico, utilizando como eluyente un ácido débil, obteniendo el péptido en agua acidificada. La obtención final de producto fue de 0,5 g/L con una pureza al 95%.

6.      Ensayo de actividad (ensayo in vitro basado en células)

Se cultivaron fibroblastos NIH3T3 de ratón y se trataron con concentraciones crecientes de CNP22 (proteína nativa) y PG-CNP37 (análogo). Se utilizó la producción de GMPc como lectura de la actividad de NPR-B (receptor B del péptido natriurético), expresado endógenamente en los fibroblastos. Cada concentración se analizó por duplicado. Tras la lisis de las células, para el ensayo de detección del punto de captura del GMPc, se obtuvieron actividades in vitro similares para ambos productos.

Conclusión

En este artículo se presenta un método sencillo y económico para la síntesis de un análogo del péptido natriurético C (CNP), PG-CNP37. CNP, debido a su escaso tamaño, es fácilmente hidrolizado por las proteasas de la célula. Para evitar la rápida degradación, este grupo de investigación procede a la expresión en E. coli de una proteína de fusión de mayor tamaño en cuerpos de inclusión y, posteriormente, a la escisión con ácido fórmico para liberar PG-CNP37 del compañero de fusión. Consiguen un rendimiento de 0,5g/L al 95% de pureza.

Las ventajas que presenta este método frente a otros son, en primer lugar, la escisión de la proteína de fusión con ácido fórmico, minimizando el elevado coste que supondría un método enzimático o la toxicidad e inespecificidad derivadas del uso de CNBr. Por otro lado, la expresión en cuerpos de inclusión del análogo PG-CNP37 supone las mismas ventajas que la producción extracelular (reducción de la proteólisis, simplificación de la producción), además de incrementar considerablemente la producción.  Para finalizar, este método también tiene como ventajas el ser un proceso simple y barato y el trabajar con una especie genéticamente muy estudiada y conocida, E. coli, cuyo rápido crecimiento en cultivo permite diseñar procesos de fermentación a gran escala.

  

Bibliografía

http://es.wikipedia.org/wiki/Acondroplasia#Tratamiento

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/001577.htm