Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


También podrás encontrar diversas páginas y blogs relacionados con el mundo de la Microbiología. El material que se presenta en ellos puede ser utilizado en clase.


sábado, 31 de mayo de 2014

Cultivo D-Stat para el estudio de los cambios metabólicos del metabolismo oxidativo en cuanto a la acumulación de lípidos y la producción de ácido cítrico


Origen de la imagen
Viendo el título de este trabajo probablemente nos hayamos quedado igual, no nos hemos enterado de mucho, ¿verdad? Pues vamos a hacer que esta exposición se entienda mejor que algunas instrucciones para montar muebles o cualquier electrodoméstico.

El título podríamos definirlo como un cultivo en el que se reducen los nutrientes para la bacteria, nitrógeno y carbono en este caso, para estudiar los cambios en relación a ciertos procesos bioquímicos que la bacteria realiza para ``quemar´´ o degradar dichos nutrientes con el fin de obtener energía y otros productos, mediante oxígeno presente, acumulando grasas y produciendo ácido cítrico (un producto formado tras el uso de dichos nutrientes).

Una vez entendido el título, vamos a explicar cómo se ha llevado a cabo el experimento.

Primero, los investigadores desarrollaron un proceso para la síntesis de una grasa (ácido graso), en este caso triacilglicerol (TAG de aquí en adelante). Como materia prima para la síntesis de dicho producto, utilizaremos un azúcar (glucosa). Este proceso es bastante importante en cuanto a la utilización de combustibles y en la industria química.

Origen de la imagen

Para sintetizar dicho ácido graso, han utilizado una levadura (como las que se usan para hacer pan, cerveza… pero no es la misma). Como sabemos, a los ácidos grasos también se les llama aceites. Aceite proviene del latín óleum, y esta raíz latina se sigue utilizando hoy en día (pintura al óleo, por ejemplo). Dicho esto, a las levaduras que sinteticen y acumulen  estos aceites las llamaremos oleaginosas. Una de las levaduras oleaginosas más representativas es Yarrowia lipolytica, que acumula dichos aceites en forma de TAG (antes descrito). Esta característica es debida al desequilibrio de los nutrientes que colocamos en el medio donde se encuentra la bacteria, es decir, la fuente de carbono está en exceso y la fuente de nitrógeno será la limitante, lo que quiere decir que será el nitrógeno el que permita o no que la reacción se lleve a cabo.

Origen de la imagen

Origen de la imagen
Tras estudiar este hecho, Ratledge y Wynn (dos científicos) propusieron un modelo para explicar la sucesión de ‘’pasos’’ metabólicos necesarios para la acumulación de estos aceites.

El experimento se realizó en cultivo contínuo y discontínuo, manteniendo las mismas condiciones y dejando al microorganismo en la misma fase de crecimiento (fase exponencial) o variando las condiciones a las que se encuentra sometido el cultivo, respectivamente. A su vez, se alternaba el suministro de un flujo constante de glucosa y sulfato amónico (glucosa como fuente de carbono y sulfato amónico como fuente de nitrógeno).

Al obtener los resultados de su experimento, observaron que con una relación de carbono/nitrógeno más o menos alta, esta levadura generaba lípidos sin necesidad de producir ácido cítrico, mientras que si se reducía dicha relación, Yarrowialipolytica ya no acumulaba tantos lípidos y aumentaba la producción de ácido cítrico.
 
Origen de la imagen
Los resultados obtenidos se podían corroborar estudiando las actividades específicas de las enzimas, relacionadas con la acumulación de lípidos y la síntesis de ácido cítrico, es decir, estudiando la cantidad de enzimas necesarias para llevar a cabo la acumulación de lípidos y síntesis de ácido cítrico. Con la relación de nitrógeno/carbono más alta, las enzimas encargadas de acumular lípidos (ATP citrato liasa, acetil-CoAcarboxilasa, enzima málica… ejemplos de algunas enzimas), esta actividad enzimática aumentaba.

Como conclusión de este experimento, afirmamos que las condiciones que limitan la acumulación de TAG, permitiendo la mínima producción de ácido cítrico, está basado en la relación entre las fuentes de carbono y nitrógeno que suministremos al medio, a grandes rasgos.

¿Por qué nos interesa este estudio aunque, a primera vista, podamos pensar que no tiene mucho futuro? La respuesta es sencilla. Aunque todavía no está muy bien estudiado dicho proceso, en un futuro, esperemos que cercano, podremos desarrollar bioprocesos industriales, tales como producir biocombustibles.



Autores del blog:

Alberto Serrano García
Mª Teresa Castaño Martínez
Noelia Sánchez Marzo
Félix Manjón Amallobieta
Salvador Giménez Bru


Referencias bibliográficas:


Abril Ochoa-Estopiera,b,c, Stéphane E. Guillouet

D-stat culture for studying the metabolic shifts from oxidativemetabolism to lipid accumulation and citric acid production in Yarrowia lipolytica

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165613004938# 


viernes, 30 de mayo de 2014

Fermentación maloláctica en vinos con bacteria ácido láctica inmovilizada – Influencia de la concentración, material de soporte y condiciones

Todos somos conscientes de la importancia de un buen vino. Su altísimo consumo ha conducido a que se haya llegado a pagar más de 150.000 € por una botella. Ante esta demanda mundial de vino de alta calidad y sus consecuentes beneficios económicos se ha investigado exhaustivamente la forma de conseguir los mejores resultados. Aquí es donde entra en juego la fermentación maloláctica (MLF):



Este proceso es llevado a cabo por la bacteria Oenococcus oeni que transforma el ácido málico en ácido láctico, lo que reduce la acidez del vino y aumenta su pH además de dar matices lácticos cambiando su textura y, en definitiva, mejorando su calidad que es lo que nos interesa.

Oenococcus oeni


Sin embargo, el vino presenta condiciones  desfavorables para el crecimiento de microorganismos por  lo que es difícil que la MLF llegue a ocurrir. Entonces  ¿Cómo conseguimos hacer crecer a la bacteria? Pues bien, se han encontrado unos materiales de soporte que la fijan y facilitan su acción y además aceleran el proceso.                                   
Estos materiales han de ser baratos y abundantes en la naturaleza, y es crucial que no afecten negativamente al producto final que en este caso era el vino blanco.
Para ello se escogieron mazorcas de maíz, piel de uva y tallo de uva (por separado) y se estudió su viabilidad en diversos lotes consecutivos, a diferentes condiciones de temperatura y concentraciones de etanol y CO2.
Una vez realizadas las distintas fermentaciones con las diferentes condiciones para escoger el mejor soporte, se llegó a la conclusión de que las mazorcas de maíz y la piel de uva eran los mejores materiales para inmovilizar la bacteria en cuestión, que además era más resistente a las altas temperaturas y grandes concentraciones de etanol y SO2, que suelen tener un efecto inhibitorio. 



Sin embargo, hubo diferencias entre estos dos soportes:
            -  Por un lado, las células inmovilizadas en maíz fueron fuertemente afectadas por el SO2 presente en el vino, aunque una vez se acostumbraban aumentaba la producción.
     - Por el otro lado las pieles no fueron afectadas por el SO2 aunque en los almacenamientos previos en el biocatalizador tuvieron un fuerte efecto negativo.                                                   
    También es destacable que en ambos casos las células inmovilizadas son capaces de permanecer activas durante largos períodos de tiempo (5 meses o más) realizando varias MLF consecutivas y aumentando así enormemente la producción.
En conclusión, se puede mejorar la calidad y producción del vino inmovilizando la bacteria que realiza su fermentación maloláctica y favoreciéndola  así, algo que gracias a las investigaciones científicas dará mejores vinos para el consumidor y mayores beneficios (si cabe) a las industrias vitivinícolas.

REFERENCIAS:
FOOD CHEMISTRY; Malolatic fermentation of wines with immobilised lactic acid bacteria – Influence of concentration, type of support material and stroge conditions elsevier.com/locate/foodchem 
- Autores
  • Z.Genisheva
  • S.I. Mussatto
  • J.M Oliveira
  • J.A Teixeira
Integrantes del grupo 13:

Javier Alonso Martínez, Isaac Benito González, Marc Buigues Caravaca, Moises Cabanes Martínez, Alberto Pérez Gago.

jueves, 29 de mayo de 2014

Ingeniería genética en Escherichia coli para mejorar la producción de etanol a partir de gluconato

Actualmente se está experimentando una creciente demanda energética. La utilización de combustibles fósiles para suplir las necesidades energéticas conlleva una serie de consecuencias perjudiciales; como puede ser el incremento de CO2 emitido a la atmósfera (resultado de la combustión de dichos combustibles) o la lluvia ácida. Es por ello que la utilización de biocombustibles como el etanol resulta una fuente de energía alternativa que es cada vez más prometedora. Concretamente, la biomasa celulósica presenta un bajo coste de producción y es muy abundante. A partir de la hidrólisis de la biomasa celulósica se obtienen tanto hexosas como pentosas, entre otros azúcares, que pueden ser transformados en biocombustibles como el etanol, mediante la actuación de microorganismos fermentadores.
Aunque existen microorganismos etanogénicos, estos se ven limitados por su capacidad para utilizar pentosas como sustratos (constituyendo estas el 90% del total de biomasa celulósica). Es decir, son homoproductoras de etanol (no producen ningún otro producto final), pero son incapaces de utilizar la fuente de monómeros más importante en la biomasa celulósica; las pentosas.
Por otro lado, Escherichia coli, aunque carece de la capacidad para producir etanol como único producto final, sí presenta la habilidad de utilizar diversos tipos de azúcares como sustrato, obteniendo rendimientos mayores de la biomasa celulósica. Además, es capaz de asimilar con mayor velocidad el gluconato, presente en la biomasa celulósica.


 ESCHERICHIA COLI Y METABOLISMO

Con el objetivo aprovechar las ventajas que presenta Escherichia coli, el estudio se centra en el metabolismo de esta bacteria anerobia facultativa. Éste se puede dividir en dos fases principales; la degradación de los carbohidratos para obtener piruvato y la degradación de éste (diferente en condiciones aeróbicas y anaeróbicas).
Las diferencias que supone la utilización del gluconato como fuente de carbono alternativa a la glucosa derivan de su  producción energética en la via de Entner-Doudoroff, convirtiéndose en piruvato (menor producción energética con respecto a la glucólisis).  En condiciones anaeróbicas se producen 2 moles de ATP y dos de NADH por mol de glucosa para dar piruvato; mientras que con gluconato solo se obtiene 1 mol de ATP y 1 mol de NADH. Para compensar esta diferencia (pérdida) de ATP, las bacterias sintetizan más productos oxidados como el acetato (que rinde ATP y NADH), produciendo lactato y etanol, con el objetivo de controlar la concentración de NADH.
Una vez obtenido el piruvato, este puede degradarse a través de cuatro rutas distintas, resumidas en el siguiente esquema:
Vías metabólicas por las que puede degradarse el piruvato (fermentaciones)

Durante el estudio realizado por los investigadores, se aprovecha la capacidad de E. coli para metabolizar diferentes productos, realizando una serie de experimentos para determinar cómo es posible incrementar el rendimiento en la producción de etanol (y disminuir la de acetato y lactato).


MATERIALES Y MÉTODOS

Para los distintos experimentos se trabajó con la cepa E. coli K011, construida mediante la integración de la ruta de producción de etanol de Zymmonas mobilis (operón PET). E. coli K011 fue transformada para llevar a cabo los experimentos en diferentes cepas que se han obtenido a partir de esta. Para la obtención de dichas cepas se han noqueado distintos genes (codifican enzimas que participan en las rutas metabólicas fermentativas) por recombinación homóloga en diferentes combinaciones de estos genes noqueados. De este modo, se pudo estudiar qué efectos producen los genes modificados en el metabolismo de la bacteria: crecimiento, productos y rendimiento. 

En los experimentos, el medio de cultivo sobre el que se ha llevado a cabo las fermentaciones contiene medio LB (Luria Bertani) y 2 % de glucosa, además del sustrato (glucosa o gluconato). El pH fue ajustado a 6.5 y se consiguieron condiciones anaerobias. Las muestras fueron extraídas a distintos intervalos de tiempo para determinar la concentración de los metabolitos y la masa celular.


RESULTADOS

- Crecimiento:
Velocidad de crecimiento máxima de E. coli K001 y las estirpes mutantes con glucosa o gluconato

Cuando la glucosa es utilizada como fuente de carbono, todas las cepas son capaces de producir la fermentación de dicho compuesto, dando lugar a etanol como producto principal (más de un 100% del máximo teórico es alcanzado). Sin embargo, E. coli K011 produce una pequeña cantidad de acetato.

Utilizando gluconato como sustrato se pueden observar tendencias similares en los mutantes a cuando se utiliza glucosa, aunque se aprecia que todas las cepas que se estudiaron utilizaban el gluconato con mayor rapidez que la glucosa, alcanzando velocidades de crecimiento mayores. El rendimiento de producción de etanol en E. coli K011 es de un 87.5% comparado con el rendimiento teórico (sin embargo, el rendimiento de acetato aumentó hasta 117%).

- Producción de etanol:

 El consumo de piruvato se encuentra desviado hacia la producción de acetil-coA. La enzima PDH es inhibida por NADH en condiciones anaerobias, pero la enzima LDH no requiere NADH para su funcionamiento. Por lo tanto, las dos vías catalizadas por estas enzimas están reguladas por NADH y evitarán la competición entre ellas. Sin embargo, la actividad de PDH no es nula en condiciones anaerobias: funciona para mantener el equilibrio entre NADH y NAD+.
Cuando se usa glucosa, el ratio NADH/NAD+ es mayor porque la glucosa es un sustrato más reducido. Esto causa que PDH quede inhibida y la producción de etanol aumente por la presencia de NADH.
Al utilizar gluconato como sustrato, la producción de acetato en general aumenta, ya que se utiliza esta vía para compensar la pérdida de ATP con respecto a la utilización de glucosa como sustrato. Además, se debe mantener un equilibrio entre NADH y NAD+, consumiéndose el exceso de NADH gracias a la formación de lactato y etanol.
Teniendo estos dos factores en cuenta, la estrategia utilizada para mejorar la producción de etanol en E. coli K011 consiste en el noqueo de los genes pflA y ldh en conjunto. El noqueo de pflA hace que solo se pueda producir acetato y ATP a la vez que NADH a través de la ruta catalizada por PDH. El exceso de NADH producido por esta vía solo puede compensarse con la producción de etanol, ya que el gen ldh también está noqueado. Por lo tanto, esta combinación es la óptima si se desea mejorar el rendimiento en la producción de etanol.

CONCLUSIÓN

Aunque la eliminación de rutas metabólicas competentes no produzca una mejora muy notable de la producción de etanol cuando se utiliza glucosa como sustrato, sí que se aprecian diferencias importantes utilizando gluconato.
En el experimento se consiguió aumentar el rendimiento de la producción de etanol a partir de gluconato gracias a al noqueo de pfl y ldh en conjunto. Sin embargo, el noqueo de estos genes afectan moderadamente a la velocidad de crecimiento de las bacterias, disminuyendo esta velocidad a un 70% de su valor en la cepa silvestre (E. coli K011).



ARTÍCULO ORGINAL

Amanda Hildebrand, Theresa Schlacta, Rebeccah Warmack,Takao Kasugab Zhiliang Fan, "Engineering Escherichia coli for improved ethanol production from gluconate", Journal of Biotechnology168 (2013) 101– 106.

*Las dos primeras imágenes han sido tomadas del artículo original


TRABAJO REALIZADO POR: 
Samuel Daniel Lup, Esther Marhuenda Segarra, Adrián Martínez Tébar, Elisa Pérez Galiano y Marta Rubio Camacho

Investigación del efecto de diferentes factores extracelulares en la producción de lipasas por Yarrowia lipolytica



Introducción:

Este artículo muestra el estudio que han llevado a cabo sus investigadores para conocer el efecto de cambios en factores extracelulares como la fuente de carbono (oleato de metilo), el oxígeno disuelto y el pH, en biorreactores a gran escala para la producción de lipasa extracelular por Yarrowia lipolytica, una levadura. Las lipasas son enzimas que disgregan las grasas, muy usadas en la industria para la fabricación de detergentes o producción de biodiésel. Para ello, se han utilizado cepas de Y. lipolytica obtenidas mediante manipulación genética que poseen unido al gen LIP2, que codifica la enzima lipasa, con un gen testigo, el lacZ, que codifica la β-galactosidasa. A partir de la síntesis paralela de ambas enzimas, podemos estimar la expresión de LIP2 por la actividad de la β-galactosidasa (hidroliza un compuesto dando lugar a otro con color amarillo, a más color amarillo, más expresión de ambos genes).
Se han utilizado biorreactores de pequeña escala clásicos y otros dos diseñados para reproducir lo que ocurre en los biorreactores a gran escala (el aumento de la escala implica imperfecciones en la mezcla). Todos ellos tienen capacidad de 20 L (con un volumen de trabajo de 12 L), y dos turbinas rushton para la agitación del medio.

http://www.ufz.de/export/data/1/27711_hefen.jpg
Yarrowia lipolytica. Origen de la imagen incrustada

Experimento:

Efecto de la disponibilidad del oleato de metilo y el oxígeno disuelto.
Se estudió el efecto de la disponibilidad del oleato de metilo para la producción de lipasa cultivando a Y. lipolityca en dos biorreactores distintos, uno clásico y un P-SDR, que presenta dos secciones (una parte mezclada y otra no mezclada). El tiempo de residencia en la parte no mezclada varía según el flujo de recircularización de la bomba. En la parte mezclada, las turbinas rushton aseguran una dispersión eficiente del oleato de metilo, pero en la parte no mezclada, se produce una caída en el nivel de la eficiencia de su dispersión, siendo perjudicial para la producción de lipasa. La disminución de la eficiencia de transferencia de oxígeno en la parte no-mezclada limita el crecimiento óptimo de las células y, por lo tanto, la producción de lipasa, por lo que se elabora otro diseño de reactor para medir las fluctuaciones de oxígeno.



P-SDR (Partitioned Scale-Down Reactor)

Aquí se observa que en la parte mixta  las turbinas rushton aseguran una dispersión eficiente del oleato de metilo pero ocurre una caída en el nivel de la eficiencia en la parte no mixta, como también se produce una disminución en la eficiencia de la transferencia de oxígeno. Imagen original.

Efecto de las fluctuaciones del nivel de oxígeno disuelto.
Se cultiva a Y. lipolytica en un biorreactor clásico y en dos C-SDR, en los cuales el flujo de aire se cierra y se abre de forma alterna por una válvula eléctrica controlada por un algoritmo específico de dos formas distintas. El primer algoritmo de control consiste en ciclos regulares de on/off donde la duración del tiempo de encendido y apagado se basan en el tiempo de residencia en la parte mezclada y no mezclada, mientras que el segundo algoritmo de control crea ciclos aleatorios de on/off. Los dos C-SDR muestran una caída significativa del nivel de producción de lipasa extracelular, más pronunciada en el caso del C-SDR con un esquema de on/off regular, donde el estrés inducido por las fluctuaciones de oxígeno disuelto es mayor. Este estrés tiene un gran impacto en el nivel de expresión de LIP2, disminuyendo el rendimiento de lipasa extracelular.


C-SDR (Controlled Scale-Down Reactor)


En los C-SDR se observa una caída significativa del nivel de producción de lipasa extracelular, más pronunciada en el caso del C-SDR con un esquema de on/off regular: las fluctuaciones de oxígeno provocan un estrés y genera un impacto en el nivel de expresión de LIP2 (Imagen original)

Efecto de las variaciones de pH locales.
Para observar el efecto de las variciones de pH se cultiva, en este caso, a Y. lipolytica en cuatro biorreactores P-SDR: dos de ellos con una regulación normal del pH, alrededor de 7, (donde el gradiente es rápidamente atenuado por la eficiencia de mezcla) y dos con una regulación en la parte no mezclada, ambos a tiempos de residencia de 2,5 y 5 min. El pH está normalmente regulado mediante la adición de base o ácido por la parte superior del reactor y la medición de pH con una sonda situada en la parte inferior del reactor, mientras que las fluctuaciones de pH se producen con la adición de  KOH o H3PO4 en la parte no mezclada del P-SDR. El rendimiento de lipasa extracelular es ligeramente inferior para el P-SDR con regulación de pH realizado en el nivel de la parte no mezclada (algo más pronunciado en el caso del tiempo de residencia de 2,5 min). Los ensayos de β-galactosidasa muestran una caída en el nivel de la expresión del gen LIP2. En general, no se percibe efecto adicional cuando creamos fluctuaciones en los  gradientes de pH. Sin embargo, observamos una modificación morfológica de las células: las células de Y. lipolytica aparecen con una morfología filamentosa.


P-SDR con gradiente de pH controlado



Finalmente, se observa que no afecta de manera tan decisiva en el crecimiento celular cuando se le añaden fluctuaciones de pH, pero en cambio, sí se puede observar una mayor caída en el nivel de expresión de LIP2 (Imagen original)

Conclusión y resultados:

El efecto de los factores ambientales en la producción de lipasa por Y. lipolytica se ha observado en dos niveles fisiológicos distintos: en condiciones de estrés leves, donde se observa impacto a nivel de la producción de biomasa y la tasa específica de la producción de lipasa; y en condiciones de estrés severo, las cuales tienen efecto directamente en el nivel de la expresión del gen LIP2, lo cual se observa, sobre todo,  en el C-SDR que produce fluctuaciones en el nivel de oxígeno disuelto. Los efectos de la dispersión de oleato de metilo y el gradiente de pH solo se observan en una reducción en el crecimiento de la biomasa y la producción de lipasa, a excepción del gradiente de pH llevado a cabo con un TR de 2,5 min, en el que se observa un ligero efecto sobre la expresión del gen LIP2. Se van a llevar a cabo más estudios para una mejor caracterización de la intensidad y la frecuencia de estos dos factores ambientales en paralelo con la caracterización en los biorreactores de escala industrial.




Investigation of the effect of different extracellular factors on the lipase production by Yarrowia lipolityca on the basis of a scale-down approach
September 2008, Volume 35, Issue 9, pp 1053-1059 

            Trabajo realizado por: Guillem Vicente Ortiz, Antonio Daniel Molina Martínez, Eva Núñez Delegido, Sofía Martínez López y Ceylan Mutlu