Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


También podrás encontrar diversas páginas y blogs relacionados con el mundo de la Microbiología. El material que se presenta en ellos puede ser utilizado en clase.


viernes, 27 de mayo de 2016

Nuevas milbemicinas obtenidas a partir del mutante Streptomyces bingchenggensis X-4


Streptomyces bingchenggensis es una bacteria gram positiva de la clase actinobacterias, perteneciente al  género Streptomyces, responsable de procesos fermentativos de materia orgánica y de la producción de milbemicinas, antibióticos macrólidos (destacados en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias intracelulares) de 16 miembros con una actividad excepcional contra diversos tipos de ácaros. Los tipos conocidos de milbemicinas son alfa1 (A3), alfa3 (A4), beta14, beta28, beta29, alfa30 y ST 906, cuatro secomilbemicinas A, B, C y D, y dos milbemicinas pentapeptídicas. Para la elevada producción de los productos A3 y A4 se obtuvo una estirpe mutante fenotípicamente diferente a Streptomyces bingchenggensis, denominada S. bingchenggensis X-4, mediante procesos de tratamiento con rayos UV, N-metil-N-nitroso-N-nitrosoguanidina (agente químico mutagénico) y técnicas de manipulación genética.  Mientras se estaba realizando la investigación de los metabolitos producidos por esta nueva cepa, aparecieron tres nuevos compuestos bastante interesantes: la milbemicina beta15 (1), secomilbemicinas E (2) y F (3) los cuales se aislaron del caldo de fermentación de S. bingchenggensis X-4. La estructura del  compuesto 1 es similar a la milbemicina D, compuesto que  se usa como plaguicida contra nematodos (una especie de gusanos) parasitarios de las plantas, además es muy selectivo y bastante potente, por lo que la bioactividad del compuesto 1 debe de investigarse más.   Respecto a las secomilbemicinas previamente descubiertas, los grupos hidroxilo (OH) en el carbono situados en la posición 5,  no se encontraban en los compuestos 2 y 3. Otro dato importante es que las milbemicinas y avermectinas obtenidas a partir de microorganismos, contienen ese grupo hidroxilo en C-5 y los derivados de estas solo se pueden obtener mediante métodos sintéticos, por lo que estos dos nuevos compuestos, que no presentan ese grupo hidroxilo característico en el carbono 5, pueden tener un papel importante en la compresión y el perfeccionamiento de las vías de biosíntesis de milbemicinas.

Para la obtención de estos compuestos se llevo a cabo una sería de procesos. En primer lugar, la cepa mutante se mantuvo en un agar inclinado, que proporciona  un medio selectivo de bajo pH útil para cultivar organismos acidotolerantes (capaces de vivir y tolerar un pH acido) y acidófilos (crecimiento óptimo en pH de 1 a 5),  a una temperatura de 28ºC durante 12 días. Luego, este medio de cultivo se traslada a un matraz en un reactor rotatorio a 250 rpm (revoluciones por minuto) durante 30 horas a 28°C. Una vez finalizado este periodo de tiempo, se inocula con 0,5 L (provenientes del matraz) un fermentador con 10 L de medio de siembra y con  una capacidad máxima  de 15 L. En este fermentador se  incuba durante 32 horas con una aireación y agitación de 1VVM (vvm = volúmenes de aire por unidad de volumen de medio por minuto) y a 180 rpm.

Después de dicha incubación, se transfirieron 3 L de este fermentador de 15 L a otro fermentador de producción con  30 L de medio de cultivo y una capacidad máxima de 50 L. En este fermentador se mantuvo a 28 ºC, con un pH inicial de 7.4 y se esterilizó por burbujeo de vapor (mediante un sparger, que es el instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al interior del fermentador) a 121ºC durante 30 min. Una vez esterilizado, se realizó la fermentación durante 10 días a 28 ºC. En todo el proceso siempre  se garantizó unas condiciones apropiadas para favorecer el proceso fermentativo.



 




Sparger, instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al fermentador.
Se trata de una especia de tubo perforado conectado un pistón, de tal manera que el movimiento horizontal de dicho pistón provoca la entrada de vapor a presión en el interior del fermentador

 

Tras la incubación durante 10 días, el caldo de fermentación (33 L) se filtró. La torta (los restos obtenidos tras la filtración) resultante fue lavada con agua, y ambos, el  filtrado y el lavado, se descartaron, ya que lo único que  interesa es la torta, donde se encuentra los productos de interés. El metanol (10 L) se utilizó para extraer la torta lavada. Alrededor de 2 L del extracto de metanol (MeOH) fueron evaporados a presión reducida y a 45 ºC , y el concentrado resultante se extrajo tres veces usando un mismo volumen de EtOAc (etanoato de etilo). Posteriormente,  la fase de EtOAc combinada se concentró bajo presión para rendir 30 g de sustancias oleosas, con las que se realizó una cromatografía sobre un gel de sílice. Después se eluyó con petróleo y éter-acetona y se obtuvieron dos fracciones, la fracción I y II. A la fracción I se le sometió a una columna de Sephadex LH-20 (lecho usado para algunos tipos de cromatografía por donde pasan o no las muestras a estudiar) en gel,  eluyendo con MeOH para así tener la subfracción I, la cual se depuró a partir de una HPLC (cromatografía liquida de altaeficacia) para así obtener un compuesto puro a temperatura ambiente.

En la fracción II se procedió de la misma manera, es decir, se realizó una cromatografía en columna de Sephadex LH-20 eluyendo también con MeOH para obtener así la subfracción II. Esta se purificó con una HPLC semipreparativa  utilizando un disolvente (contiene una mezcla de CH3OH-CH3CN-H2O) para obtener así un compuesto puro a temperatura ambiente, en este caso la milbemicina β15.

Una vez que se realizó la purificación y concentración de los compuestos, el compuesto 1 se aisló como un aceite incoloro con UV y se estableció su fórmula molecular, siendo esta C33H50O7 que se deduce mediante una ionización de alta resolución por electrospray (HRESI)

También se realizó una RMN (resonancia magnética nuclear) para descubrir la estructura de cada compuesto, y esta técnica consiste en aplicar un campo magnético externo que va a provocar que los núcleos de los átomos a analizar se orienten en la misma dirección que el campo magnético externo. La radiofrecuencia utilizada para excitar estos núcleos nos va a dar un espectro de emisión de estos núcleos, que liberarán esta energía cuando se deje de inducir el pulso de radiofrecuencia y los núcleos reorienten su campo magnético local a su posición inicial.


De esta forma se ha logrado extraer milbemicinas por procesos fermentativos de una estirpe mutante de Streptomyces bingchenggensis, que han adquirido una gran importancia biotecnológica  ya que, actualmente,  se utilizan como acaricidas frente a ácaros adultos de Tetranychus urticae y como nematocida contra Caenorhabditis elegans.


Integrantes del grupo:

Ricardo Requena Platek
Guillermo del Barco Aldaz
Manuel Garrido Romero
Rubén Mollá Albaladejo
Joan Sánchez Pascual




Referencias bibliográficas:

"New milbemycins from mutant Streptomyces bingchenggensis X-4"

The Journal of Antibiotics (2011) 64, 753–756; published online 17 August 2011
Bao-Xin Zhang, Hui Zhang, Xiang-Jing Wang, Ji-Dong Wang, Chong-Xi Liu and Wen-Sheng Xiang

1 comentario:

  1. ¿Por qué aparece el texto sobre un fondo blanco?

    Habéis usado distintos tipos de letra incluso dentro del párrafo

    Os repito lo que os dije en clase. Aunque ponéis un enlace a lo que son las milbemicinas, habría quedado mejor si además hubierais incluido la imagen al principio del texto.

    El texto carece de carácter o tono divulgativo. Es una traducción del artículo

    El cultivo en agar inclinado no tiene nada que ver con que un microorganismo crezca a un pH o a otro. Lo que influye en el pH es la composición del medio, no la forma en que ese medio se dispone.

    "Sparger" se traduce como "difusor". Lo hemos visto en clase (el difusor de oxígeno en el biorreactor).



    ResponderEliminar