Este blog está asociado a las páginas web de las asignaturas de Microbiología del Grado de Biotecnología y del Grado de Ciencias Ambientales de la UMH.

Aquí se publican los resúmenes de los diferentes trabajos realizados por los alumnos de la asignatura Microbiología Industrial.


También podrás encontrar diversas páginas y blogs relacionados con el mundo de la Microbiología. El material que se presenta en ellos puede ser utilizado en clase.


viernes, 27 de mayo de 2016

Aplicación de la proteína PhaR reguladora de la síntesis de polihidroxialcanoato (PHA) como biosurfactante y agente bactericida

El primer paso para que este resumen divulgativo cumpla su objetivo de explicar de una manera más comprensiva y amena el contenido del artículo en el que se basa nuestro trabajo es comprender el título. Para ello debemos definir conceptos como polihidroxialcanoato o biosurfactante.

Los PHA (polihidroxialcanoatos) son poliésteres lineales sintetizados por algunos microorganismos como mecanismo de almacenamiento de fuente de energía.

PHA. Fuente
Los biosurfactantes, por otro lado,  son moléculas anfipáticas (parte hidrofóbica + parte hidrofílica) que influyen por medio de la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases (son por ejemplo detergentes, geles de ducha, lavavajillas…). Cada vez van teniendo más importancia a nivel industrial como emulsionantes, agentes humectantes (jabones y alcoholes), etc. Son por tanto de gran importancia e interés económico.

Surfactante o tensoactivo. Fuente

El artículo se centra en la proteína represora PhaR, capaz de unirse a la superficie de los gránulos intracelulares de PHA. Así, además de esta característica, PhaR posee otras características interesantes que hacen que sea un buen biosurfactante con una elevada capacidad emulsionante. Los experimentos que se realizan en el artículo tratan de optimizar esta capacidad que tiene la proteína PhaR como emulsionante, surfactante y como posible agente bactericida.

Lo primero que hicieron en el experimento es obtener la proteína mediante técnicas de ingeniería genética. Una vez obtenida, empleando diversas técnicas de análisis se comprobó su capacidad surfactante, y se comparó con varios surfactantes químicos comúnmente usados, siendo PhaR el que mostró un mejor resultado (mayor % de emulsión).

Gráfica que compara PhaR con otros surfactantes químicos

Por otro lado, PhaR es estable a altas temperaturas, tanto a nivel de estructura como de función (la altas temperaturas no afectan a su capacidad surfactante). Por tanto, la estabilidad térmica de esta proteína es muy útil para el proceso de pasteurización, es decir, un proceso empleado en la industria alimentaria para eliminar agentes que son patógenos (por ejemplo, se usa en la leche). Además, PhaR presenta diversas ventajas a nivel industrial. En este artículo se estudió la obtención de PhaR en forma de lisados celulares, esto quiere decir que no hay que gastar dinero en la purificación y procesamiento de la proteína, etapa bastante limitante económicamente a escala industrial. Por tanto, como utilidad de este experimento y en cuanto a perspectivas futuras se concluyó que PhaR tiene una aplicación como biosurfactante a gran escala.

Otras utilidades de los experimentos que explica este artículo fueron, en primer lugar, que a diferencia de los surfactantes químicos comúnmente usados que tienen la desventaja de la contaminación secundaria, PhaR posee baja toxicidad y es biodegradable, por tanto, es más adecuado como agente de emulsión, humectante, penetrante etc. para industrias alimentarias, de bebidas, de productos farmacéuticos, de cosméticos, petrolera y minera, y plantas de tratamiento de aguas residuales.

Aplicaciones. Fuente
En segundo lugar, tras estudiar las características de PhaR, se observó que podría presentar muchas ventajas en la industria cosmética, sobre todo para las cremas de manos, pues PhaR ayudaba a extender mejor la crema en la piel y a ser absorbida por ésta.

Finalmente, y una de las conclusiones del artículo más importante para la actualidad es el uso de PhaR como agente bactericida. Se estudió su efecto utilizando dos bacterias y en ambas PhaR inhibió el crecimiento. Por consiguiente, PhaR tiene una actividad antibacteriana muy parecida a la de los antibióticos, por ello promete ser un método muy interesante para evitar la resistencia a antibióticos. Destacar, que actualmente, la resistencia a los antibióticos es uno de los mayores problemas que se presentan para curar ciertas enfermedades y que la investigación sobre esto requiere tanto dinero que cada vez hay menos empresas que se dedican a ello. Por tanto, poder llegar a usar PhaR como posible alternativa es un gran paso que hay que seguir investigando y poder llegar a resultados bastante exitosos.


Bibliografía
Hong-Kun Ma, Ming-Ming Liu, Shi-Yan Li, Qiong Wu,
Jin-Chun Chen, Guo-Qiang Chen.

Application of polyhydroxyalkanoate (PHA) synthesis regulatory
protein PhaR as a bio-surfactant and bactericidal agent.

MOE Key Lab of Bioinformatics, Department of Biological Science and Biotechnology, School of Life Science, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences,
Tsinghua University, Beijing 100084, China
Mutidisciplinary Research Center, Shantou University, Shantou 515063, China
Center for Nano and Micro Mechanics, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Realizado por:
Valeria Aguilar Quiñones
Débora Cerdá Bernad
Miriam Nicolás Albujer
Erik Ramón Gil
José Ramón Fernández

Nuevas milbemicinas obtenidas a partir del mutante Streptomyces bingchenggensis X-4


Streptomyces bingchenggensis es una bacteria gram positiva de la clase actinobacterias, perteneciente al  género Streptomyces, responsable de procesos fermentativos de materia orgánica y de la producción de milbemicinas, antibióticos macrólidos (destacados en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias intracelulares) de 16 miembros con una actividad excepcional contra diversos tipos de ácaros. Los tipos conocidos de milbemicinas son alfa1 (A3), alfa3 (A4), beta14, beta28, beta29, alfa30 y ST 906, cuatro secomilbemicinas A, B, C y D, y dos milbemicinas pentapeptídicas. Para la elevada producción de los productos A3 y A4 se obtuvo una estirpe mutante fenotípicamente diferente a Streptomyces bingchenggensis, denominada S. bingchenggensis X-4, mediante procesos de tratamiento con rayos UV, N-metil-N-nitroso-N-nitrosoguanidina (agente químico mutagénico) y técnicas de manipulación genética.  Mientras se estaba realizando la investigación de los metabolitos producidos por esta nueva cepa, aparecieron tres nuevos compuestos bastante interesantes: la milbemicina beta15 (1), secomilbemicinas E (2) y F (3) los cuales se aislaron del caldo de fermentación de S. bingchenggensis X-4. La estructura del  compuesto 1 es similar a la milbemicina D, compuesto que  se usa como plaguicida contra nematodos (una especie de gusanos) parasitarios de las plantas, además es muy selectivo y bastante potente, por lo que la bioactividad del compuesto 1 debe de investigarse más.   Respecto a las secomilbemicinas previamente descubiertas, los grupos hidroxilo (OH) en el carbono situados en la posición 5,  no se encontraban en los compuestos 2 y 3. Otro dato importante es que las milbemicinas y avermectinas obtenidas a partir de microorganismos, contienen ese grupo hidroxilo en C-5 y los derivados de estas solo se pueden obtener mediante métodos sintéticos, por lo que estos dos nuevos compuestos, que no presentan ese grupo hidroxilo característico en el carbono 5, pueden tener un papel importante en la compresión y el perfeccionamiento de las vías de biosíntesis de milbemicinas.

Para la obtención de estos compuestos se llevo a cabo una sería de procesos. En primer lugar, la cepa mutante se mantuvo en un agar inclinado, que proporciona  un medio selectivo de bajo pH útil para cultivar organismos acidotolerantes (capaces de vivir y tolerar un pH acido) y acidófilos (crecimiento óptimo en pH de 1 a 5),  a una temperatura de 28ºC durante 12 días. Luego, este medio de cultivo se traslada a un matraz en un reactor rotatorio a 250 rpm (revoluciones por minuto) durante 30 horas a 28°C. Una vez finalizado este periodo de tiempo, se inocula con 0,5 L (provenientes del matraz) un fermentador con 10 L de medio de siembra y con  una capacidad máxima  de 15 L. En este fermentador se  incuba durante 32 horas con una aireación y agitación de 1VVM (vvm = volúmenes de aire por unidad de volumen de medio por minuto) y a 180 rpm.

Después de dicha incubación, se transfirieron 3 L de este fermentador de 15 L a otro fermentador de producción con  30 L de medio de cultivo y una capacidad máxima de 50 L. En este fermentador se mantuvo a 28 ºC, con un pH inicial de 7.4 y se esterilizó por burbujeo de vapor (mediante un sparger, que es el instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al interior del fermentador) a 121ºC durante 30 min. Una vez esterilizado, se realizó la fermentación durante 10 días a 28 ºC. En todo el proceso siempre  se garantizó unas condiciones apropiadas para favorecer el proceso fermentativo.



 




Sparger, instrumento utilizado para suministrar vapor a presión al fermentador.
Se trata de una especia de tubo perforado conectado un pistón, de tal manera que el movimiento horizontal de dicho pistón provoca la entrada de vapor a presión en el interior del fermentador

 

Tras la incubación durante 10 días, el caldo de fermentación (33 L) se filtró. La torta (los restos obtenidos tras la filtración) resultante fue lavada con agua, y ambos, el  filtrado y el lavado, se descartaron, ya que lo único que  interesa es la torta, donde se encuentra los productos de interés. El metanol (10 L) se utilizó para extraer la torta lavada. Alrededor de 2 L del extracto de metanol (MeOH) fueron evaporados a presión reducida y a 45 ºC , y el concentrado resultante se extrajo tres veces usando un mismo volumen de EtOAc (etanoato de etilo). Posteriormente,  la fase de EtOAc combinada se concentró bajo presión para rendir 30 g de sustancias oleosas, con las que se realizó una cromatografía sobre un gel de sílice. Después se eluyó con petróleo y éter-acetona y se obtuvieron dos fracciones, la fracción I y II. A la fracción I se le sometió a una columna de Sephadex LH-20 (lecho usado para algunos tipos de cromatografía por donde pasan o no las muestras a estudiar) en gel,  eluyendo con MeOH para así tener la subfracción I, la cual se depuró a partir de una HPLC (cromatografía liquida de altaeficacia) para así obtener un compuesto puro a temperatura ambiente.

En la fracción II se procedió de la misma manera, es decir, se realizó una cromatografía en columna de Sephadex LH-20 eluyendo también con MeOH para obtener así la subfracción II. Esta se purificó con una HPLC semipreparativa  utilizando un disolvente (contiene una mezcla de CH3OH-CH3CN-H2O) para obtener así un compuesto puro a temperatura ambiente, en este caso la milbemicina β15.

Una vez que se realizó la purificación y concentración de los compuestos, el compuesto 1 se aisló como un aceite incoloro con UV y se estableció su fórmula molecular, siendo esta C33H50O7 que se deduce mediante una ionización de alta resolución por electrospray (HRESI)

También se realizó una RMN (resonancia magnética nuclear) para descubrir la estructura de cada compuesto, y esta técnica consiste en aplicar un campo magnético externo que va a provocar que los núcleos de los átomos a analizar se orienten en la misma dirección que el campo magnético externo. La radiofrecuencia utilizada para excitar estos núcleos nos va a dar un espectro de emisión de estos núcleos, que liberarán esta energía cuando se deje de inducir el pulso de radiofrecuencia y los núcleos reorienten su campo magnético local a su posición inicial.


De esta forma se ha logrado extraer milbemicinas por procesos fermentativos de una estirpe mutante de Streptomyces bingchenggensis, que han adquirido una gran importancia biotecnológica  ya que, actualmente,  se utilizan como acaricidas frente a ácaros adultos de Tetranychus urticae y como nematocida contra Caenorhabditis elegans.


Integrantes del grupo:

Ricardo Requena Platek
Guillermo del Barco Aldaz
Manuel Garrido Romero
Rubén Mollá Albaladejo
Joan Sánchez Pascual




Referencias bibliográficas:

"New milbemycins from mutant Streptomyces bingchenggensis X-4"

The Journal of Antibiotics (2011) 64, 753–756; published online 17 August 2011
Bao-Xin Zhang, Hui Zhang, Xiang-Jing Wang, Ji-Dong Wang, Chong-Xi Liu and Wen-Sheng Xiang

jueves, 26 de mayo de 2016


El artículo se basa en el estudio del microorganismo Rhodotorula mucilaginosa  (antiguamente llamado Rhodotorula rubra) y la manera de cultivarlo para su uso en la producción de biocombustibles. Además de ser una especie de levadura unicelular pigmentada, es un microorganismo aerobio estricto. Se caracteriza por formar colonias de color anaranjado/rojizo cuando crece en SDA (Agar Sabouraud Dextrosa).


Rhodotorula Mucilaginosa

Este microorganismo tiene gran interés en la microbiología industrial porque puede usarse para la producción de biocombustibles, ya que presenta un rápido crecimiento, es capaz de almacenar una gran cantidad de lípidos y puede consumir más de una fuente de carbono.

A continuación, se adjunta el enlace a un vídeo donde se explican otras de las características de dicho microorganismo:

La hipótesis se basa en que el microorganismo puede almacenar diferentes cantidades de lípidos en función de las condiciones de crecimiento, obteniéndose una mayor cantidad cuando se cultiva en fed-batch.

R. mucilaginosa puede tolerar grandes cantidades de NaCl (sal) hasta el 7%, aunque algunas de sus actividades biológicas se ven reducidas. La hipótesis señala que la acumulación de glicerol intracelular bajo condiciones osmóticas severas ejerce un papel crucial en la osmorregulación.

El propósito de emplear esta levadura es conseguir una materia prima más económica para hacer biocombustibles. Con el objetivo de disminuir el gran consumo de recursos hídricos y el precio del proceso de fermentación llevado a cabo por este microorganismo, se utiliza agua de mar en lugar de agua pura.

En el artículo  se efectúan tres experimentos, de los cuales se van a desarrollar con mayor detalle el primero y el último:
  • El primero de ellos registra el crecimiento de R. mucilaginosa a distintas concentraciones de NaCl.
  • El segundo estudia el efecto de la combinación de agua de mar y agua pura, en diferentes proporciones, en el crecimiento del microorganismo.
  • El tercer experimento comenta los efectos del agua de mar en el crecimiento de R. mucilaginosa en un biorreactor de ascenso de aire de 5 litros.

Cabe añadir que dichas fermentaciones se han llevado a cabo en un biorreactor de ascenso de aire sin dispositivo de agitación, utilizando R. mucilaginosa congelada en seco en medio de cultivo con glicerol y agua de mar. Además, la cepa empleada fue mutada con NTG para aumentar la acumulación lipídica.

En el primer experimento que trata el artículo se analiza el efecto de las distintas concentraciones de NaCl en diferentes agitaciones. El objetivo de este experimento consiste en conocer la viabilidad del crecimiento de R. mucilaginosa con agua de mar. Para ello, los cultivos fueron examinados en matraces de agitación utilizando 60 g/l de glicerol en bruto como fuente de carbono. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente gráfica:

fig 1.PNG

Dicha figura indica cómo un aumento progresivo de la concentración de NaCl produce una disminución de la biomasa, del crecimiento celular, del contenido lipídico y de β-caroteno. Sin embargo, en un estudio anterior realizado con Rhodotorula glutinis, se demostró que un aumento de la presión osmótica produce un incremento en el contenido lipídico y un decremento en el de polisacáridos. No obstante, la composición cualitativa de los lípidos intracelulares no varía.

A pesar de no conocer las razones por las cuales Rhodotorula sobrevive a altas concentraciones salinas, se estima que podría haber una relación entre la salinidad del medio y la concentración intracelular de glicerol, siendo éste el responsable de equilibrar la presión osmótica del medio intracelular con respecto al medio salino.

Aunque no se conoce la concentración interna de glicerol, los resultados obtenidos por Zheng y sus colaboradores demostraron que R. mucilaginosa puede tolerar altas concentraciones salinas sin conllevar a un cambio en el contenido lipídico.

Otro de los experimentos que se estudia en el artículo es el efecto de las diferentes proporciones de agua de mar y de agua pura en el crecimiento de R. mucilaginosa.

En la figura siguiente, si se compara la cantidad de biomasa obtenida, se observa un menor crecimiento cuando se emplea un porcentaje muy alto de agua de mar. Podemos concluir que ésta es una disminución significativa en la cantidad de biomasa. Sin embargo, en cuanto al contenido lipídico, los efectos derivados de añadir agua de mar no son claros, pues la cantidad lipídica obtenida es similar tras realizar los diferentes experimentos en los que variamos las proporciones de agua pura y agua de mar. De este hecho se deduce que, aunque una alta presión osmótica en el cultivo en batch con agua de mar puede disminuir el crecimiento celular, no altera la acumulación lipídica de R. mucilaginosa.Captura.JPG

El tercer experimento que se explica en el artículo son los efectos del agua de mar en el crecimiento de R. mucilaginosa en un biorreactor de ascenso de aire.

Los resultados obtenidos en éste demuestran que usando agua de mar en lugar de agua pura, el crecimiento de R. mucilaginosa disminuye. Sin embargo, el agua de mar es una opción más atractiva debido al bajo coste y al uso limitado del agua. En la siguiente gráfica se muestra una comparación entre el uso de agua de mar y el uso de agua pura y, en la tabla, los datos cinéticos relacionados:

fig 3.PNG

table 2.PNG
En esta tabla, podemos observar que la velocidad de crecimiento de biomasa es mayor en el cultivo en batch con agua pura que con agua de mar. No obstante, la cantidad máxima de biomasa obtenida es similar en ambos cultivos. Además, una velocidad de crecimiento más lenta, nos indica un retraso en el crecimiento celular por la alta presión osmótica. Debido a este retraso, la cantidad máxima de biomasa tardará más tiempo en ser alcanzada. Por otra parte, el alargamiento de la fase de crecimiento conduce a una acumulación mayor de lípidos en las células cultivadas en batch con agua de mar.

A pesar de estos inconvenientes, las razones por las que R. mucilaginosa sobrevive no son claras. Sin embargo, la síntesis de glicerol intracelular ha de ser un factor relevante en la osmorregulación de la levadura. A continuación, se muestra cómo oscilan las diferentes variables en función del tiempo cuando se cultiva R. mucilaginosa en un cultivo en batch con agua de mar:
figura 4.PNG

En esta figura se observa la disminución simultánea de la osmolaridad y salinidad conforme transcurre el tiempo de cultivo. Esto sugiere que este microorganismo podría utilizar directamente el NaCl para reducir la salinidad del medio, además de los efectos osmorreguladores de la formación de glicerol intracelular.

tabla 3.PNG

En esta tabla podemos observar diversos cambios en la concentración de los diferentes ácidos grasos de la especie R. mucilaginosa, la cual ha sido cultivada en dos medios distintos: uno de agua pura y otro de agua de mar. Los resultados demuestran que tanto el uso de agua de mar como de pura no modifican significativamente el contenido lipídico. De esta forma, podemos concluir que el uso de agua de mar es apropiado para la acumulación total de lípidos en la levadura.

En definitiva, la concentración salina aplicada genera una disminución en el crecimiento del microorganismo. Al mismo tiempo, se ha demostrado que existe una correlación entre el aumento de la concentración de NaCl y el aumento de glicerol intracelular. Esto es así porque este lípido juega un papel crucial en la osmorregulación. Por otra parte, variando las proporciones de agua de mar y agua pura se observó que no cambiaba el rango de lípidos intracelulares, solamente el tiempo que tardaban las células en conseguirlos.

El objetivo final de este experimento es obtener una materia prima para la producción de biocombustibles, tales como el biodiesel o el bioetanol.

Experimentos similares a los narrados en este artículo ya se han llevado a cabo empleando algas, concretamente especies unicelulares y cianobacterias. El principio en el cual se basa es el mismo que el ya descrito: la acumulación de aceites intracelulares, los cuales se pueden transformar en biocombustibles. El experimento con el microorganismo narrado podría aumentar la eficiencia del proceso y abaratar costes, ya que se conoce perfectamente la ingeniería necesaria para crecer levaduras industrialmente y podría además solventar algunos de los problemas que surgen en cuanto al crecimiento de algas, como el auto-oscurecimiento o la necesidad de añadir elementos como el fósforo al medio de cultivo.
También podría plantearse la creación de un biocombustible de tercera generación combinando ambos organismos mediante ingeniería genética.

Dichos combustibles son una alternativa para reducir la contaminación y la emisión de gases de efecto invernadero producidos por los combustibles fósiles. Además, suponen una fuente de energía alternativa frente a dichos combustibles y ayudan a la creación de empleo, dado que algunos de ellos requieren de materias primas que se tienen que cultivar.

A continuación se muestra un vídeo en el que se explica un poco más acerca de estos biocombustibles y cómo nos ayudarán en un futuro:
https://www.youtube.com/watch?v=zrui4tnH-Cc

Bibliografía:

Hong-Wei Yen, Yu-Ting Liao, and Yi Xian Liu
Cultivation of oleaginous Rhodotorula mucilaginosa in airlift bioreactor by using seawater
Journal of Bioscience and Bioengineering. VOL. 121 No.2, 209-212, 2016.

Grupo compuesto por: Valeria Navarro Pérez, Laura García Abad, Gema Puebla Planas, Laura Brazales Esquitino y Marina García Bejarano.